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TMT標記定量蛋白質組學技術

TMT技術是技術是由美國Thermo Scientific公司研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用2種、6種或10種同位素的標簽,特異性標記多肽的氨基基團,經過串聯質譜LC-MS/MS分析,可同時比較2組,6組或最多10組不同樣品中蛋白質的相對含量。

技術原理

TMT?標簽由三部分組成:分子量報告子、分子量標準化部分和反應基團, 質量報告基團有2/6/10種不同的分子量,質量標準化基團也2/6/10有種不同的分子量,與不同的報告基團搭配形成2種、6種或10種相對分子質量均等量的異位標簽。保證被標記的不同來源的同一肽段在一級質譜中具有相同的質荷比;氨基反應基團能與肽段N端及賴氨酸側鏈氨基發生共價連接使肽段連上標記。

                                                             

                                                                                  TMT?標簽結構示意圖    

實驗流程  

 TMT?試劑通過反應基團能夠高效地標記酶解后的肽段。在一級質譜圖中,分子量標準化部分使任何一種TMT?試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,可剪切臂能夠優先斷裂以便釋放分子量報告子。每個報告子都有各自獨特的分子量,并且能夠在MS/MS分析中反應出所標記的多肽的樣品豐度,根據報告離子的信號強度值可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

                                                              

                                                                            TMT實驗流程圖(以6標為例)

技術路線

                                   

技術優勢 

      靈敏度高:可檢測出低豐度蛋白; 

      分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等; 

      適用范圍廣:可以對任何類型的蛋白質進行鑒定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等; 

      高通量:可同時對10個樣本進行分析,特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析; 

      結果可靠:定性與定量同步進行,同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息; 

      自動化程度高:液質連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。                                                                                         

     應用領域 

科研: 研究特定疾病發生的遺傳變異,如單基因遺傳病、罕見疾病基因檢測等。 

農業: 用于品系鑒定、優勢性狀篩選、群體遺傳學分析、親緣關系分析等 

動植物: 動植物生長發育、抗病、抗逆機制研究以及育種研究。同時可實時更新和補充關聯信息的完整性 

醫學: 闡釋疾病的發生發展機制,發現與疾病相關的生物標志物, 以應用于疾病診斷、治療、預后及用藥研究。

儀器類型

Thermo Scientific Q Exactive、AB SCIEX Triple TOFTM fusion plus

樣品要求 

1.蛋白運輸:24小時內可以4℃運輸;

2.蛋白長期保存:-20℃;

3.待檢測蛋白要求:蛋白量最低300μg,濃度最低要求為1μg/μl,否則同位素無法標記;

4.蛋白提取試劑要求:使用普通的組織、細胞裂解液即可,切忌不要使用二維電泳試劑提取;

5.直接提供組織或細胞:動物、微生物組織濕重>10mg;植物鮮嫩組織>100mg;細胞量>107個;血液體積>500μl。 

 


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