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蛋白質組學及修飾組學

時間:2017-09-14
一.行業背景
人類基因組的解碼開創了以基因解析為特征的個體化醫學新時代。然而,基因型與疾病表型的不相關性揭示出個體化醫學的本質在于疾病最相關的功能分子----蛋白質。蛋白質修飾(Protein Post-translational Modification, PTM)是蛋白質行使功能的最高級形態,是表觀遺傳現象的核心內容。因此,以蛋白質修飾-表觀遺傳為特征的生物醫學研究是個體化醫學領域的最前沿。
表觀遺傳學是研究不涉及DNA序列改變的基因表達和調控的可遺傳修飾, 即探索從基因演繹為表型的過程和機制的一門新興學科。表觀遺傳學信息提供了何時、何地、以何種方式去執行DNA遺傳信息的指令, 它通過有絲分裂和減數分裂將遺傳信息從上一代傳遞給下一代。表觀遺傳學的研究內容分為基因轉錄過程中的調控和基因轉錄后的調控兩部分 。主要包括DNA甲基化, 組蛋白修飾, 非編碼RNA等。
組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的重要方向之一。組蛋白有很多修飾形式, 包括乙酰化、甲基化、琥珀酰化,巴豆酰化,磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化等等。由于組蛋白和DNA組成的核小體是染色質結構包裝的基本單位,組蛋白修飾能夠通過改變核小體構象最終影響整個染色體的結構和功能。組蛋白修飾在轉錄調節,DNA修復,DNA復制,可變剪切和染色質凝集過程中發揮重要作用,因此也與重大疾病和表型變化密切相關。
蛋白質修飾與表觀遺傳學是生物醫學最前沿的研究領域,是21世紀生命科學與生物技術產業化的戰略前沿和主要突破口。國際人類蛋白質組組織宣布全面啟動“國際人類蛋白質組計劃(HPP)”到國內陸續出來各項政策文件明確宣示在國家政策層面上重點支持個體化醫學和蛋白質組學研究與產業化轉化。
時間 到了2015年,奧巴馬在國情咨文中宣布了一個預算為2.15 億美元的精準醫學計劃(Precision Medicine);何為精準醫療?精準醫療是指以個人基因組信息為基礎,結合蛋白質組、代謝組等相關內環境信息,為患者量身設計出最佳治療方案,以期達到治療效果最大化和副作用最小化的一門定制醫療模式。緊隨其后,中國宣布在2030年前,在精準醫療上將投入600億元,其中中央財政支付200億元,企業和地方財政配套400億元。這意味著以蛋白質組和修飾組為核心的技術將迎來產業化的春天,學了這么多年的生物,做了這么多年實驗,我們終于不用再抱怨今天學生物流的汗是當年填志愿腦子進的水,我們廣大志在生命科學領域一展宏圖的蟲友們,需要努力打下扎實的專業基礎,為屬于我們行業的時代積蓄力量!
二,專業知識
前面扯得有些遠,OK,進入正題。蛋白質的組學層面的研究,主要通過對病毒,微生物,植物,動物,以及人類的蛋白質在不同的環境和條件的影響下,表達水平和修飾水平的變化,來尋找關鍵的影響基因表達調控和細胞信號通路的蛋白,從而為生物性狀改良,診斷標記物篩選和藥物靶點的尋找提供科學基礎。
在常規蛋白質組學上,主要實驗流程為樣品制備——蛋白提取——酶解肽段——HPLC分組分——LC-MS質譜檢測——生物信息學分析(GO注釋,KEGG通路,蛋白結構域和蛋白互作等等)。
在修飾蛋白質組學上,多了一個修飾抗體富集修飾肽段的過程,主要實驗流程為樣品制備——蛋白提取——酶解肽段——修飾抗體富集(乙酰化,甲基化,琥珀酰化等等)——HPLC分組分——LC-MS質譜檢測——生物信息學分析(GO注釋,KEGG通路,蛋白結構域和蛋白互作等等)。
而在定量蛋白質組學中,常用的標記技術為iTRAQ/TMT技術(樣品為組織),和SILAC(樣品為可穩定穿代的細胞),下面針對這2中標記技術原理和標準分別闡述:
1,iTRAQ/TMT定量蛋白質組學技術
(1)技術簡介
研究不同生理病理條件下組織內蛋白質的表達水平的變化是比較蛋白質組學的核心內容。要揭示上述動態過程往往需要進行多個樣本的同步比較分析。近年來,在體內和體外穩定同位素標記基礎上,用多維相色譜分離多肽,進而用串聯質譜進行相對定量的分析方法已成為高通量比較蛋白質組研究的主要手段之一。
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術是由美國AB Seiex公司研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用多達8種穩定同位素標簽,通過特異性標記多肽的氨基基團,然后進行串聯質譜分析,可同時比較多達8種不同樣品中蛋白質的相對含量。
(2)技術優點
l iTRAQ標記技術可在一次實驗同時對多達8個樣本進行定量分析,降低了反復實驗引入的技術誤差,8個樣品之間可進行任意兩兩比較,增加實驗設計的靈活性。可用于多個時間點蛋白質組動態變化的監測;靈活增加實驗重復/技術重復以及進行多個個體樣本的研究。
l 該技術為體外標記,可標記各種動物組織、植物組織、微生物、體液、細胞等樣本。
l 重復性好,靈敏度高,蛋白覆蓋范圍廣,在單張譜圖中同時進行定性與定量。
l 標記完全,標記效率高達97%以上,等質量的同位素標簽不增加樣品的復雜程度。
l 一次實驗可定量3000-5000種蛋白(2個unique peptides以上)。
(3)技術原理
l iTRAQ試劑由三部分組成:1)報告基團(reporter group)相對分子質量分別為113、114、115、116、117、118、119和121 Da; 2)平衡基團(balance group)相對分子質量分別為192、191、190、189、187、186和184 Da; 3)反應基團(peptide reactive group)形成8種分子量為305 Da的等質量同位素標簽。
l iTRAQ試劑標記酶解后的肽段,可與氨基酸N端及側鏈的一級胺發生反應。在一級譜圖中,來自于不用樣品的同一肽段,標記后,表現為相同的質荷比。
l 在二級質譜中,報告基團、平衡基團和反應基團之間的鍵斷裂,帶不同同位素標簽的同一肽段產生質量為113、114、115、116、117、118、119和121Da的報告離子,根據報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。
(4)送樣標準
l 動物組織的樣品量濕重不少于200 mg。
l 植物或真菌、細菌、噬菌體等微生物類樣品量濕重不少于2 g。
l 富含雜質或蛋白質含量低的樣品量濕重不少于5 g;如植物的根,木質部、韌皮部組織等。
l 體液類(唾液、羊水、腦脊液等)10 mL以上,要保證不能溶血;血清要求500 μl以上;尿液要求50 mL以上。
l 如直接提供蛋白質提取物,濃度不少于2 mg/mL,總量不少于1 mg。為保證實驗效果,請盡量告知緩沖液成分,如是否有硫脲、SDS、強離子鹽等等。另樣品中應不含核酸、脂類、多糖等影響分離效果的成分。
l 在細胞器蛋白質組學方面,提取細胞器或亞細胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。
三 , 修飾蛋白質組學應用
目前針對不同物種的普通蛋白質組學譜圖數據,已經不再具有新穎性。必須要針對得到的組學數據得到的關鍵蛋白進行深入挖掘,進行功能驗證,才能成為一篇漂亮的工作。而蛋白質翻譯后修飾是和蛋白質功能息息相關,如組蛋白乙酰化和去乙酰化直接關系到轉錄激活與沉默,細胞中各種激酶直接受到磷酸化調節其活性。而從組學層面研究這些修飾目前還看還是非常新穎的方向。無論針對一個物種的修飾譜圖解析,還是針對某一種修飾(乙酰化,琥珀酰化等)在不同處理的生物樣品中的差異,從而解析出和蛋白功能相關的修飾,為分子診斷和藥物靶點以及農林性狀改良提供新型的技術基礎。下面針對不同的case一一解析:
1,蛋白質修飾定性組學
針對某一個物種(如水稻,擬南芥,小鼠,斑馬魚等)里的新型修飾做修飾組學譜圖,可作為一個領域的開創性的工作。定性不需要標記樣品。
(1)技術路線

適用于乙酰化、磷酸化、甲基化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丁酰化、丙二酰化、泛素化等一系列修飾類型的蛋白質修飾全譜分析,可以檢測出全蛋白中發生特定修飾的幾乎所有蛋白及對應蛋白上的修飾位點。

(2) 應用
運用高質量泛乙酰化抗體偶聯的樹脂和高靈敏度液相質譜聯用分析,以及高級生物信息學分析,我們在大腸桿菌中鑒定了349個乙酰化修飾蛋白共1070個乙酰化修飾位點,報道了迄今為止單一原核細胞中最大的乙酰化組。

2,蛋白質修飾定量組學
針對動物組織,植物組織和細胞系,進行不同處理后,使用iTRAQ和SILAC標記技術,研究其在不同處理條件下,修飾水平的差異變化。

3, 生物標志物,藥物靶點和修飾酶底物的尋找
尋找生物標志物(Biomarker):通過對正常組織和疾病組織的修飾組學,找到在疾病中廣泛存在變化的修飾底物,即潛在的生物標志物或藥物靶點,為臨床診斷提供依據。
尋找藥物靶點:通過對用藥和未用藥的疾病細胞系或者模式生物,找到在用藥后顯著發生變化的修飾底物,可作為藥物靶點,為新藥篩選和設計提供參考;

 4.尋找修飾酶底物:在藥物篩選和病原微生物互作中,在我們關注到修飾酶起重要調控作用后,我們想一步延伸尋找其對下游其他修飾底物(特別是涉及到關鍵通路和代謝上的修飾)是否還會發生影響。我們需要將酶活性進行抑制或者直接KO該酶基因,然后通過修飾組學看下有底物的變化

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